杨美祥等
0 引言
细胞骨架是胞质中一组由纤维状结构组成的网架，普遍存在于真核细胞中，具有支撑和维持细胞形态及细胞运动的功能。关于微丝等细胞骨架结构在受到外力后的反应研究较少。本文通过给体外培养的人牙周膜成纤维细胞施加流体剪切力、周期性牵张力和静压力，观察不同时间内细胞形态和细胞骨架的变化特征，研究外力通过微丝系统对细胞的影响。
1 材料和方法
1.1 人牙周膜细胞的培养和鉴定 收集因正畸矫治需要而拔除的健康牙齿，在超净台内用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗数次，然后用眼科剪刮取牙根中部1/3处牙周膜组织，在最低必需培养液(α-MEN)培养液浸润下将组织剪切成0.5mm×0.5mm×0.5mm×%5大小的碎块，均匀平铺于灭菌的25mL培养瓶底，将瓶底向上，加入含100mL/L胎牛血清(FCS),100u/mL青霉素，100mg/L链霉素的α-MEN全培养液4mL，置CO2青霉素，37℃孵育。24h后将瓶底翻转向下继续培养，每4d换液1次，约2周左右，细胞从组织块中游出。当细胞铺满瓶底约1/2时，用2.5g/L胰酶消化，进行首次传代，传代比例为1:1。以后当细胞铺满瓶底约80%-90%时按1:2或1:3传代，所培养的细胞经免疫细胞化学检测呈抗波形丝蛋白阳性，抗角蛋白阴性。证明细胞来源于中胚层。以第3代的细胞作为研究对象。
1.2 剪切力的施加 将细胞接种于放置0.8cm*0.8cm的盖玻片的24孔板内，当细胞生长接近80%时，放在37℃水平摇床中，转速定为35r/min，加力1、2、6、12、24h，多聚甲醛固定30min，对样本进行观察及染色。对照组为37℃的普通孵箱培养的细胞。
1.3 周期性牵张力的施加 取第4-6代HPDLC,按1×10?/孔接种于具有弹性基底膜的6孔培养板(BioFlex?;FLEX-CELL INTERNATIONAL CORPORATION)内。培养2d当细胞基本融合后，换含20mL/L FCS的α-MEN培养液再换液1次。当细胞密度生长至80%时将培养板固定于弹性基底膜加载装置上，选择加力条件为5s拉伸、5s松弛6cycle/min，基底膜发生12%形变率的周期性牵张力，继续培养加力1、2、6、12、24h，多聚甲醛固定30min，收集细胞及条件培养液。
1.4 静压力加载装置及加载方法 细胞加载装置使用本院修复科研制的可控压力细胞加载装置即流体静压力加载装置。该装置主要由高压储气室、控压加载室、气流量调控器、压力检测器、计时器等组成。高压储气室储备50mL/L CO2 ,950mL/L空气，气压大于1.0MPa。控压加载室通过气流量调控器与高压储气室连接，并由压力检测器和气流量调控器控制加载室室内压力，室内压力与设定压力之误差小于5%。本实验使用100kPa压力。将细胞接种于放置0.8cm*0.8cm的盖玻片的24孔板内，加压1、2、6、12、24h，多聚甲醛固定30min，进行观察和染色。
1.5 考马斯亮蓝显示微丝结构 细胞玻片经固定后，黏固于载玻片上，蒸馏水漂洗2遍，各2min，10mL/L Triton X-100室温下处理5min，2g/L考马斯亮蓝染液(甲醇46.5mL，冰醋酸7.0mL;蒸馏水46.5mL,考马斯亮蓝0.2g)中室温染色6min，置入甲醇冰醋酸液(甲醇46.5mL，冰醋酸7.0ml，蒸馏水46.5mL,不含燃料考马斯亮蓝)中分化，脱水，透明，封固。
2 结果
正常对照组细胞呈梭形，排列比较乱，没有明显的方向性。剪切力、周期性牵张力作用6h后，细胞部分收缩，边界清晰，细胞间隙增大，出现死亡脱落细胞;随着时间延长，形态变化加剧，死亡脱落细胞增加，细胞形态缩小。周期性牵张力组细胞比较乱，形态变小纤维明显较对照组短、细，散乱分布于胞质内，方向性较差。静压力组细胞形态变大，铺展明显，边界清晰，死亡细胞较少。
细胞骨架微丝的变化基本同细胞的形态改变一致。对照组细胞的微丝围绕细胞核排列紧密，呈束状平行排列或呈染色均匀一致的膜状结构，排列整齐;无明显的方向趋势(图1)。经过6h的剪切力作用，部分细胞的伸展方向趋向于摇床转动使得液体流动的方向，尤其是爬片外周更加明显，细胞呈不对称的形态，下游纤维突起伸展较长，胞体较宽大(图2)周期性牵张力组细胞细胞骨架比较乱而密，加力后1h即出现排列紊乱、丝状结构变细变短(图3)。静压力组细胞扁平，体积增大，微丝间距增宽(图4)。
3 讨论
牙周膜成纤维细胞是牙周组织的主要组成部分之一，起着连接，缓冲外力、传递信息的作用，是牙周膜中最重要的功能细胞，与牙槽骨构成身体中改建最活跃的区域，可以合成胶原、基质、弹力纤维和糖蛋白等。牙周膜主要纤维均有一定的排列方向，这与牙齿受力的性质和方向关系密切。流体剪切力具有明确而恒定的方向性，使得受力的细胞发生相应的排列改变，既可能是流体物理作用的结果，也可能是生物的一种适应性本能。静压力由于没有明显的方向性，所以不能改变细胞的排列方向。因为周期性牵张力的动态效果也造成细胞贴壁不牢，细胞骨架收缩，细胞体积变小。
机械力对牙周改建作用影响较大，是创伤合导致牙周损伤、正畸矫治牙列不齐等现象的基础。随着信号传导研究的深入，人们发现细胞骨架对力学信号的传递起着重要的作用，其功能受到不同信号的调节。本实验利用水平摇床使培养板内的培养液按照一定的方向流动，使贴壁的成纤维细胞受到与液体流动方向相同的剪切力。成纤维细胞对这种应力的反应结果表现为细胞形态和排列方向的改变，细胞微丝骨架在受力方向上的几何重排是其结构基础。细胞死亡、凋亡的增多可能是流体剪切力的冲刷作用使得部分贴壁不牢的细胞漂浮所致，同时也造成细胞数量减少，间隙增大。
机械力作用于细胞和周围的基质，借助于细胞膜上分子感受器的直接接触，通过细胞骨架传导将机械力传到细胞的各个部位，使相应的效应分子激活，合成、分泌等功能发生变化，对细胞的增殖、分裂、运动等产生影响。 微丝与细胞膜形态的维持有关。在周期性的机械力、太空失重状态下，骨细胞骨架可以发生重排，而细胞骨架的量在加力后可能没有变化。有人研究认为，牙周组织中骨架成分的增龄性变化较大，vimentin，F-actin在成牙本质细胞和成纤维细胞中逐年减少，可能与咀嚼力的变化有关。
牙周成纤维细胞施加膜张力后中间丝和微管等细胞骨架成分没有明显改变，与未拉伸细胞相比，免疫荧光显示的细胞骨架结构没有变化。静压力、周期性牵张力和流体剪切力对牙周膜细胞产生不同的效果，剪切力、周期性牵张力时细胞形态和微丝结构发生显著改变，时间延长可使细胞脱落、死亡(凋亡);而静压力引起的变化则较轻微。其原因可能是因为牙周膜细胞体内时主要承受压力和张力，细胞对压力的适应性较强，而剪切力主要存在于血管壁等部位，生理状态下对牙周膜细胞负载较小，细胞适应性较差，容易发生病理性损伤，同时，也与细胞的黏附性直接相关。
对机械力起响应的结构主要是微丝，是由双股F-actin螺旋式组成的。说明在机械力作用下微丝结构有明显变化，提示机械刺激可促使F-actin解聚。机械力对细胞骨架的影响，包括复杂的力学因素与生化因素的相互作用。细胞形态学变化是细胞骨架系统主动变化的结果，是细胞骨架的内在改变引起的外在表现，并不是内皮细胞对剪切应力的被动适应。微丝的这种改变是可逆的，外力刺激去除后微丝得到了重建或改建。
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